操作规程

一、复苏

1、事先用Matrix进行培养皿/板的包被处理。平时Matrix保存在-20℃，使用之前放在4℃冰箱或冰上进行解冻。待Matrix解冻后，按1：100的比例迅速用PBS液体稀释。按6孔板每孔加1ml，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量加入，加入后迅速摇动皿/板，使加入的Matrix*覆盖整个皿底。放到37℃培养箱中4小时，使用前去掉包被液（如果暂时不使用，用封口膜密封，在4℃冰箱能保存一周）。

2、复苏前准备iCell解冻*培养基（iCell解冻液基础培养基以及iCell解冻液添加剂）。加入适量的解冻液（6孔板每孔加2ml，150px皿加3ml，250px皿加9ml），另加入10ug/ml的Y27632因子，放入37℃培养箱中。

3、复苏一支细胞用5ml的上述混合培养基，复苏之前要在37℃水浴锅里充分预热。从液氮罐里取出冻存管后，迅速转移到生物安全柜中（如果液氮罐的位置距离安全柜远，要用装有液氮的容器把冻存管转移到安全柜），并用加热好的*培养基进行解冻（用移液枪不停的往冻存管中打入—抽出培养基，交换溶解开的细胞，直至*溶解）。

4、200Xg离心5分钟，去掉上清液，加入1ml的iCell*解冻培养基（含10ug/ml的Y27632因子），用手指弹碎管内沉淀。按接种到每孔板/皿1ml的量，补充iCell*解冻培养基到离心管中，轻轻吹吸三四次后加入培养皿/板中。水平十字振动使细胞均匀分布，5%CO2、37℃培养箱中培养24小时。

5、24小时后换成iCell*培养基（iCell基础培养基以及iCell基础培养基添加剂）。以后每隔22—24小时换液。细胞长满80-90%需要传代或冻存。

二、传代/冻存
1、传代前要进行培养皿/板的包被处理，做法与复苏时相同。培养基为iCell*培养基，同时加入10ul/ml的Y27632因子。

2、传代/冻存前，准备37℃预热好的无钙镁离子PBS溶液及传代工作液（0.5mM EDTA+0.025%胰酶）。

3、吸走iCell*培养基，并加入37℃预热好的PBS溶液清洗二次。

4、加入适量（按6孔板每孔加1ml，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量）的37℃预热好的传代工作液。

5、37℃放置4-5分钟（前一分钟过后拿出来，用手指轻弹几下板/皿的底部），显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞间出现间隙但尚未相互分离，肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白，表明细胞消化时间理想。

6、迅速吸去传代液，加入适量的iCell*培养基终止消化，用移液器扇形吹打皿/板底部（吹打不用超过10次），使附着的细胞集落脱落。（如果消化时间不当，致使细胞*从皿/板底剥离的情况，不用吸出传代液，加入同等量的iCell*培养基终止消化）。

7、移入离心管，离心后重悬。传代比例为1：8—1：12；冻存按6孔板每孔冻1支，150px皿冻2-4支，250px皿冻6-12支。每支加入0.8ml的90%iCell*培养基与10%的DMSO。

8、复苏时按冻存前的1：4—1：6的比例进行。

注意事项
1、每次换液时要观察细胞生长状况以及细胞形态的变化并对细胞进行拍照，但是在培养箱外操作的时间不要过长，避免因温度对细胞生长状态造成不利影响。

2、更换培养基之前，要对新的培养基进行37℃预热。为了避免反复加热培养基而造成的培养基中各种成分的影响，只对本次要更换的量进行预热处理。

3、用移液器吹打细胞，因为移液管的端部较为圆滑，对细胞伤害的程度小于用1ml的枪。

4、细胞密度达到80-90%时要及时传代，否则会造成细胞形态的变化。但是，如果细胞在铺板时混合不均匀，而形成部分集落过大的情况，即使没有达到80-90%也要进行传代。