细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒

清洗

在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器 皿和重新使用的培养器皿都要严格*的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同 的清洗方法。

玻璃器皿的清洗

组织细胞培养中，使用量大的是玻璃器皿，故工作大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。

（1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被 溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有 大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求*浸入，不 能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的 杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清 洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器 皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于 6 小时。 清洁液可根据需要，配制成 不同的强度，常用的下列三种： 重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）（A）强 清洁液 63∶1000∶200000（B）次强清洗液 120∶200∶1000（C）弱清洁液 100∶100∶100。

清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒 搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。

（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，用蒸馏水清洗 3-5 次，晾干备用。

胶塞的清洗

细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先 用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸 10-20 分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用 1% 稀 盐酸浸泡 30 分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸 10-20 分钟，晾干备用。

塑料制品的清洗塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用 2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用 5% 盐酸溶液浸泡 30 分钟， 后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

消毒

细胞培养的大危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是 由于操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不*。由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。 消毒方法分为三类：物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤、过滤等），化学灭菌法（各种化 学消毒剂）和抗生素。

（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线 直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外 线灯应距地面不超过 2.5 米，且消毒进物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作 用。紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不 宜近照射。

（2）温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用广泛、效果接近的消毒方法。温热消毒时， 消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。 在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气 阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。 消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及表皮意外事 件发生。

常用物品消毒压力及时间：

培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃, 15 磅, 20 分钟；

布类、玻璃制品、金属器械等物品：先 121℃, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干；

玻璃瓶：干热灭菌 170℃, 4 小时。

（3）化学消毒法：常见的是 70% 酒精及 1‰ 的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤， 操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消 毒。化学消毒法操作简单、方便有效。

（4）抗生素消毒：主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。

细胞培养常用物品

细胞培养基

目前，市场上可提供干粉培养基和液体培养基。干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制。液体培养基是由专业产家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便。

血清（略）

平衡盐液体

PBS（Phosphate-Buffered Sallines）

DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）标准型

Hanks’ 平衡盐溶液（Hanks’ Balanced Salt Solutions，HBSS）

D-Hanks’ 平衡盐溶液 (D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)

消化液：

分离组织和分散细胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠 (EDTA) 两种溶液。可以 单独使用，也可以混合使用。

（1）胰蛋白酶溶液

胰蛋白酶（简称胰酶）是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存。目前应用的胰蛋白酶主要来自牛或猪的胰腺。胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相 互离散。胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。一般来讲，胰酶浓度大、作用温度高、作用时间长，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。胰 酶溶液在 pH8.0，温度为 37℃ 时，作用能力。注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无 Ca2+、Mg2+的 D-Hanks』 平衡盐溶液配制成 0.25% 溶液。消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对 细胞的消化作用。

胰蛋白酶溶液配制：

（1）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许 D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状， 然后再补足 D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温 4 小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；

（2）次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度 为 0.25% 或 0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调 pH 至 7.2 左右。

保存条件：配制好的胰蛋白酶溶液必须保存在-20℃ 冰箱中，以免分解失效。

EDTA•4Na 溶液

EDTA 是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离觧作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便。 常用工作液浓度为 0.02%。通常与 0.25% 的胰蛋白酶溶液按 1：1 混合使用（混合液）。

注意：使用 EDTA 处理细胞后，一定要用 Hanks 液冲洗干净，因残留的 EDTA 会影响

细胞生长。

EDTA 溶液配制：用无钙、镁的 D-HBSS 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶， 室温或 4℃ 冰箱保存。

胰蛋白酶–EDTA•4Na 溶液（0.05% 胰蛋白酶, 0.53 mM EDTA•4Na）

0.5 g 胰蛋白酶＋0.2 gEDTA•4Na＋1L D-HBSS。-20℃ 冰箱中保存。

pH 调整液

（1）NaHCO3 溶液

常用浓度为 7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌，分装，4℃ 冰箱或室温保存。 当 pH 值超过后，可用高压灭菌的 10％ 醋酸溶液或通入 CO2 气体方法调节。

（2）HEPES（分子量 238.31）溶液

HEPES 使用终浓度一般为 10-50 mM, 但通常配成 1M 储存液：用 200 ml 双蒸水溶解 47.6 克 HEPES，用 1N NaOH 调节 pH 至 7.5-8.0; 然后过滤除菌，分装小瓶，室温或 4℃ 保存。 抗生素溶液

酚红：

大多数培养液中使用酚红作为 pH 指示剂。红色表示中性 pH，黄色代表酸性 pH，紫色表 示碱性 pH。但是，在一些特殊培养液中不含酚红，因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用。

丙酮酸钠：

是细胞液中细胞的另一种碳源。D-葡萄糖是细胞优选碳源，但是当培养液中 D-葡萄糖耗 尽时，细胞可以代谢丙酮酸钠获取碳源。

抗生素

哺乳动物细胞冷冻保存

主要目的：（1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的主要目的。

（2）减少细胞被微生物污染的危险性。

（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。

（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。

（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。

(6) 降低人力和物力。

冷冻保存要点：（1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在 4℃ 冰箱中放置 30－60 分钟；然后转入-20℃，放置 30 分钟；然后再转入-80℃ 放置 16－18 小时（或过夜）；后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到 -3℃ 速度降温，一直 到-80℃ 以下，然后直接放入液氮中长期保存。

（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于 90％，无微生物污染。

（3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。

（4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存*细胞生长培养液中血 清浓度大于 20％。

（5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，常用 的冷冻保护剂是 DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为 5－10％。但是，有些细胞系不能用 DMSO 作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系 HL-60。因为，DMSO 能诱导 HL-60 细胞分化。在这种情 况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）, 羟乙基淀粉等。

特别注意：（1）细胞在冷冻过程中在-20℃ 冰箱内放置时间不可超过 1 小时，以防止冰 晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃ 这一步骤直接放入-80℃ 冰箱中，但这样做细胞存活率要

低一些。

（2）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。

（3）DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的 DMSO 本身处于无菌状态，第1次开瓶后应 立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃ 保存。避免反复冻融造成 DMSO 裂解产生有 害物质。并可减少污染机会。如要过滤 DMSO，必须选用耐 DMSO 的尼龙滤膜。

细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。

常用细胞冷冻保存液：（1）10％DMSO ＋ *细胞生长培养液（20％ 血清＋基础培养液）

（2）10％ 甘油 ＋ *细胞生长培养液（20％ 血清＋基础培养液）悬浮细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）：

（1）取对数生长期细胞培养物，离心 200－400 g 5 分钟。用粘附（贴壁）细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）：

冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃ 水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在 1 分钟内全部融化（不要超过 3 分钟）。

（2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快， 而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含*生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1 ml 冻存细胞液加入到 25－30 ml 新鲜*培养液中），24 小时后再用新鲜*培养替换旧培养液，以去除 DMSO。如果，细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后 的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含*生长培养液的培养瓶中。

特别注意：（1）解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。，要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入 37℃ 水浴中。切不可直接用手，以免冻伤。

（2）冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。

解冻冷冻保存细胞的离心方法:

(1) 从液氮中取出冻存的细胞，立即放入 37℃ 水浴中快速解冻。

（2）将 1－2 ml 冻存细胞液加入到 25 ml 新鲜*细胞生长培养液中，轻轻混匀。

（3）用 80 g 离心 2－3 分钟，弃上清液。

（4）用*生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。

（5）接种细胞到培养瓶中，起始密度为 3×105/ml。