实验原理：

冻存和复苏的原则：慢冻快融。

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。复苏细胞应采用快速融化的方 法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

实验材料

15ml离心管、培养皿、滴管 、酒精灯、培养瓶、培养液、PBS、75%酒精、0.25%胰酶、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、显微镜、计数板、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、液氮罐、冻存管、冻存液、废液缸等。

实验步骤：

一、细胞冻存

1.吸取传代后的细胞悬液，离心，去除培养液，加入冻存液，分装冻存管（冻存管内细胞数目一般为（5～10）×106个/ml，2ml冻存管中一般放1～1.5ml细胞）。

2.按步冻存

冷冻保存方法一：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮长期保存。

二、细胞复苏

1.取出冷冻管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，移入无菌操作台内。

2.打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

3.1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

4.加适当培养液后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。

注意事项

1、吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。

2、不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等所有可能不细胞接触的部分，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

3、开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。

4、换液时倾倒废液，瓶口不能接触废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。

5、吹打细胞时，要注意边角的细胞是否吹打下来。

6、手或相对较脏的物品丌能经过开放的瓶口上，即不可以在开放容器上方操作。

7、每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。

8、注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如DMSO，并避免尖锐物品伤人等。

9、从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但对数生长期细胞。在冻存前一天换一次培养液。

10、将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。

11、冻存和复苏一般用新配制的培养液。