以下实验方案介绍了贴壁培养哺乳动物细胞传代的一般流程。请注意昆虫细胞与哺乳动物细胞传代的一些关键步骤有所不同。更多信息请参阅下一页的“昆虫细胞传代的注意事项”部分。

为自己所用的细胞系传代时，建议您严格遵守实验中所有产品附带的操作说明。偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常，甚至培养*失败。

所需材料      ：装有贴壁细胞的培养容器

              ：经过组织培养处理的培养瓶，培养板或培养皿

  ：*生长培养基，预热至37℃

  ：一次性无菌15-ml试管

  ：37℃培养箱，充有二氧化碳浓度为5％的湿化空气

  ：平衡盐溶液，例如：杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS），不含钙、镁和酚红  

  ：解离剂，例如：胰蛋白酶或TRYPLE™EXPRESS,不含酚红

              ：用于活细胞和总细胞计数的试剂和设备，例如：countess™||自动细胞计数仪、台盼蓝染料或血球计数器。

贴壁细胞传代流程    所有与细胞接触的溶液和设备均为无菌状态。必须采用正确的无菌技术，并且在层流通风橱内工作。

1. 从培养容器中吸出用过的细胞培养基并丢弃
2. 用不含钙和镁的平衡盐溶液冲洗细胞（每10cm ²)培养表面面积需要2ml溶液）。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次。

注：冲洗步骤可去除可能抑制解离剂作用的少量血清、钙和镁。

1. 从培养器中吸出冲洗液并丢弃。
2. 向培养瓶中加入预热的解离剂（例如：胰蛋白酶或tryple™）；试剂量应足以覆盖细胞层（每10cm2大约0.5ml）。轻轻摇晃容器，使试剂*覆盖细胞层。
3. 将培养容器在室温下孵育约2分钟。请注意实际孵育时间根据所用细胞系不同而有所差异。
4. 在显微镜下观察细胞解离情况。如果解离程度未达90％，可将孵育时间延长几分钟，每30秒钟检查一次解离情况，也可轻轻拍打培养容器以加快细胞解离。
5. 细胞解离程度大于90％时，倾斜培养容器，使细胞上液体尽快流尽。加入所用解离剂两倍体积的预热*生长培养基。吹打细胞层表面数次，使培养基分散。
6. 将细胞转移到15-ml锥形管中，以200×g的离心力离心5至10分钟。请注意离心速度和时间依细胞种类不同有所差异。
7. 用少体积的预热*生长培养基重新悬浮细胞沉淀，取出少量样品进行计数。
8.   采用血球计数器、细胞计数仪按照台盼蓝拒染法或者使用countess™||自动细胞计数仪测定总细胞数和活细胞百分比。必要时，可再次向细胞中加入生长培养基，以便达到所需的细胞溶度，并重新进行计数。

注：我们建议使用countess™||自动细胞计数仪测定细胞数和活细胞百分比。Countess™||自动细胞计数仪计数所需的样本量与您目前使用的血球计数器所需量相同，且不到10秒钟即可完成一个样本的典型细胞计数，适用于各种真核细胞。

             11：将细胞悬液稀释到该细胞系推荐的接种密度，并将适量体积的细胞悬液转移到新的细胞培养容器中，把细胞放回培养箱。

             注：如果使用培养瓶，将其放入培养箱前应将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换，除非您使用的是通风式培养瓶和透气性瓶盖。

贴壁昆虫细胞传代的注意事项

虽然昆虫细胞传代的一般步骤与哺乳动物细胞相同，但是这些培养系统的一些关键要求有所不同。为了获得满意结果，实验中必须严格遵守所有产品附带的操作说明。

1. 昆虫细胞应在对数期传代。但是，如果培养的是强贴壁性昆虫细胞，则应在细胞达到汇合状态或者刚刚开始从培养瓶底部脱离时进行传代，因为此时细胞容易脱离。
2. 细胞密度低于汇合状态的20％时，细胞生长会受到抑制。健康状态的细胞是对数期收获的细胞。
3. 培养昆虫细胞时建议不要二氧化碳交换。
4. 昆虫细胞应于27℃、非湿化环境中培养。在避光条件下可将细胞放在操作台上或者放入抽屉中于室温下培养。但是，建议使用温度控制在27℃的环境。
5. 使用昆虫细胞的培养基。
6. 在无血清培养条件下，昆虫细胞与基质贴附极为牢固，需要花费较大力气才能使其脱落。要使细胞脱落，可以采用拍掌的动作快速振摇一下培养瓶。为了避免污染，进行此操作前必须盖紧盖子。

  警告：建议不要剧烈摇晃培养瓶，因为这样可能会造成细胞损伤。

PS:如需细胞培养相关产品，敬请联系我司！